Главная страница Список все работ и книг Страница автора
ПРИОНЫ
Прионы – класс видоспецифичных паразитических белков нескольких линий (штаммов), вызывающих нейродистрофии у животных и людей [18]. Cтэнли Прузинер, получивший за исследования в этой области Нобелевскую премию 1997г., назвал эти белки в начале 80-х прионами (protein infectious virion). Прионы вызывают заболевания типа “скрэйпи” (у овец) и так называемого “коровьего бешенства” или губчатого энцефалита. У людей – это болезни “куру”, “синдром Крейцфельда-Якоба”, “синдром Гертсмана-Штраусслера-Шейнкера”, “синдром Альперса”, “фатальная семейная инсомния”. В этой области достигнуты большие успехи. И все-таки, ключевые тонкие механизмы развития патологических состояний такого рода остаются неизвестными [23]. Мыши с нокаутом гена prn-p устойчивы к инфекции PrPsc, что демонстрирует необходимость наличия PrPc для развития губчатой энцефалопатии [8]. Были изолировали РНК-аптамеры (РА), которые могли точно распознавать рекомбинантный прионовый белок хомяка, присоединенный к глутатион S-трансферазе. При этом РА были чувствительны к определенным аминокислотным последовательностям. Характерным для РА является наличие гуанин-обогащенного изгиба РНК с образованием локальных 4-х спиральных участков РНК с повторяющимися гуаниновыми квартетами, которые названы Г-квадриплексами или Г-тетрадами. Существенно, что они характерны и для хромосомных теломер. Такая 4-х спиральность проявляется как неканоническое спаривание оснований, отличное от Уотсон-Криковского и существующее благодаря стабилизации такого комплекса аминокислотами белков [23]. В цитируемой работе Вейса и др. были поставлены вопросы, имеющие некоторое отношение к предлагаемой идее работы генома на иных принципах (см. ниже). Эти вопросы таковы: (i) как РА распознают прионовые белки?, (ii) как РА связываются с прионовыми белками? (iii) достаточна ли точность распознавания РА-ми прионовых белков в гомогенатах мозга инфицированных и неифицированных животных?
Прионовые белки (PrPsc) имеют штаммовую специфичность, и в этом они подобны бактериям и вирусам. Фенотип и функции последних определяются их геномами. Но прионы, если их выделить из пораженных тканей в чистом виде, не имеют в своем составе нуклеиновых кислот. Попадая в желудок (или другие ткани), прионы мигрируют каким-то необъяснимым образом в головной мозг, размножаются там, вызывая его морфо-функциональную деградацию. Непонятно как преодолевается дистанция Желудок Мозг, перекрытая гематоэнцефалическим барьером. Это остается загадкой, хотя есть предположения, что лимфа служит промежуточным этапом транспорта PrPsc в головной мозг. Предполагается, что этот белок может через нервные окончания ретроградно проникать по аксонам в спинной и головной мозг. Последний механизм, хотя не объяснен и не доказан, имеет определенное обоснование в новой теории нервного импульса [25] (см. ниже). В организме людей, животных, и даже дрожжей синтезируются нормальные не инфекционные прионоподобные белки (PrPc), аналогичные по своей аминокислотной последовательности белкам прионов. Имеются и соответствующие гены, ответственные за синтез PrPc. Кроме отсутствия функции патогенности, PrPc отличаются от PrPsc по вторичной структуре. При их взаимодействии в мозгу или in vitro PrPc переходит в PrPsc с уменьшением доли -спиралей и увеличением области пептида, занятой -складчатой структурой. Все последующие порции синтезируемых в мозгу PrPc также приобретают - структуру и, соответственно, функцию PrPsc. Роль "нормального" PrPc в биосистемах остается пока неизвестной, хотя есть предположения, что она заключается в обеспечении нормального функционирования клеток Пуркинье [19].
Что касается дрожжевых прионов (Psi+ и Sup35) у Saccharamyces cerevisiae, то они поставили в тупик генетиков, поскольку оказалось, что они передают генетические наследуемые признаки без участия ДНК или РНК [University of Chicago Medical Center press release, 1997].
Самое непонятное, и с нашей точки зрения ключевое, в понимании сущности прионов - факт вирусоподобной штаммовой специфичности в патогенезе, вызываемом разными типами PrPsc (их известно более 20), при видимом отсутствии у них ДНК или РНК, то есть генетического аппарата. Гены различных PrPc незначительно отличаются по нуклеотидным последовательностям. Мутации этих генов могут вызывать конверсию PrPcPrPsc с последующим накоплением PrPsc и заболеванием. Известны случаи спонтанного образования прионовых штаммов у пожилых людей и старых животных. И это также непонятно. Размножение прионов длительно. Для мышей, в зависимости от штамма, продолжительность инкубационного периода от 50 до 500 дней. У людей это годы. Развитие прионов сопровождается макроскопическим, несовместимым с жизнью, накоплением в мозгу полимерных нитей PrPsc, которые способны к окрашиванию Конго красным и двойному лучепреломлению. Последнее означает, что прионовые бляшки вызывают расхождение лучей право- и лево поляризованного света. Этот, казалось бы незначительный факт, и вроде бы не имеющий отношения к прионовым синдромам, представляется не случайным по отношению к патогенным свойствам прионов (см. ниже).
В последнее время резко усилился интерес к теломерам и теломеразе в аспекте проблемы старения (см., например, Биохимия, т.62, выпуск 11, ноябрь 1997г.; том целиком посвящен проблеме теломер и теломеразе). Последующее цитирование по теломерам взято из этого источника.
В 1961г. Л.Хейфлик и П.Мурхед показали ограниченность репликативной способности нормальных фибробластов человека. Когда нормальные эмбриональные клетки человека растут в наиболее благоприятных условиях, старение и смерть их неизбежно наступает после ~50 удвоений популяции. Это проявление внутренних свойств самих клеток. Наблюдение было воспроизведено другими многочисленными исследованиями. В то же время раковые клетки, пассируемые в аналогичных "идеальных" условиях бессмертны. В чем причина смертности одних клеток и бессмертия других? В 1971г. А.М.Оловников предположил, что причина старения и смерти на клеточном уровне заключается в недорепликации ДНК-полимеразой (теломеразой) концов хромосом (теломер) при клеточных делениях [31]. Это связано с использованием затравочных РНК-праймеров при синтезе ДНК от 5'-конца к 3'-концу и их последующим удалением. При этом 5'-конец реплики остается недореплицированным. С каждым актом репликации хромосом их концы укорачиваются на размер, занимаемый теломеразой. Этот размер иногда - своеобразная "мертвая зона", в которой не происходит удвоение однотяжных ДНК при делениях клеток. И это происходит до тех пор, пока не начинаются утраты жизненно важных кодирующих последовательностей ДНК, граничащих с теломерами. Такие утраты некоторые исследователи считают синонимом старения. Число укорочений теломер служит репликометром, определяющим количество делений, которые должна совершить нормальная клетка. После достижения минимального критического числа повторяющихся теломерных последовательностей TTAGGG, клетки теряют способность к делению. Так считалось до недавнего времени.
Оказалось, однако, что ситуация значительно сложнее. Существуют механизмы противостояния эффекту "мертвых зон". Один из них обнаружили Грейдер и Блэкберн на Tetrahymena. Именно эти исследователи открыли терминальную трансферазу - рибонуклеопротеиновый фермент, который получил название "теломераза". Оказалось, что теломеры после каждого деления клеток синтезируются теломеразой заново. Фермент достраивает 3' - конец теломер и, таким способом, удлиняет теломеры, компенсируя эффект "мертвой зоны", иногда с лихвой. Теломераза оказалась необычной обратной транскриптазой, то есть РНК зависимой ДНК полимеразой со своей собственной матрицей РНК для синтеза коротких повторяющихся последовательностей концевых ДНК хромосом. Наиболее хорошо изучена матричная область РНК Tetrahymena thermophila. Эта область содержит 9 нуклеотидных остатков в позиции от 43 до 51 (5'-CAACCCCAA-3'). Из них только 7 нуклеотидных остатков (43-49) являются собственно матричными, они составляют активную часть теломеразы и определяют каталитические функции фермента. Теломераза была затем обнаружена в экстрактах иммортализованных клеток человека. В отличие от нормальных смертных клеточных штаммов линии аномальных бессмертных клеток не стареют и продуцируют теломеразу. Поэтому теломеры иммортализованных клеток не укорачиваются при последовательных пассажах in vitro. Особенно эффективно такая защита от укорочений ДНК представлена у раковых клеток. В норме также обнаруживаются аналогичные процессы, например, в тканях плода и семенниках.
Есть еще одна особенность в механизмах сохранения теломер, которая, как и в случае синтеза прионов в головном мозгу в варианте болезни куру, непонятна и является предметом анализа настоящей статьи. Как уже ясно, иммортализация клеток человека в культуре обычно связана с экспрессией теломеразной активности. Однако, в некоторых случаях теломеразная активность не выявляется, хотя сравнение паттернов терминального рестрикционного фрагмента (TRF) до и после иммортализации показывает, что удлинение теломер действительно произошло. Крайняя гетерогенность длин теломер и различия динамики поддержания теломер в теломеразонегативных линиях в сравнении с теломеразопозитивными линиями показывают, что эти клетки использовали один или более альтернативных (ALT) механизмов удлинения теломер (ALT - Alternative Mechanism for Lengthening of Telomeres). Существенно, что все исследованные к настоящему времени линии клеток с ALT имеют сходный паттерн TRF. Это говорит, возможно, за общий механизм ALT. Все теломеразонегативные иммортализованные линии клеток, исследованные до настоящего времени, имели признаки ALT-активности, что согласуется с гипотезой, что поддержание теломер при помощи теломеразы или ALT необходимо для иммортализации. Природа механизма (или механизмов) ALT в настоящее время неизвестна, хотя есть предположение, не основанное на эксперименте, что здесь может работать механизм рекомбинационного удлинения теломер.
Таким образом, приходится констатировать, что в рамках ALT-пути имеет место необычный феномен синтеза ДНК "в отсутствие" кодирующей вещественной комплементарной матрицы ДНК или РНК. Это дополняет список сходных "аномалий", начатых с непонятных способа проникновения прионов в мозг и отчетливого вирусоподобного поведения прионовых белков при видимом отсутствии у них ДНК или РНК, то есть, в последнем случае, без геноструктур сохраняется информация о генетических штаммовых признаках прионов. Суда же попадает "аномалия" с дрожжевыми прионами, некоторые генетические признаки которых передаются опять-таки без матриц ДНК или РНК.
И, наконец, третий феномен, входящий в рассматриваемое семейство "безматричных аномалий" при синтезе полинуклеотидов. Это функционирование Qb-репликазы, РНК зависимой РНК-полимеразы колифага Qb. В системе in vitro Qb-репликаза может работать как машина саморепликации молекул РНК. Это показано достаточно давно [16, 20]. Замечательным оказалось свойство этого фермента синтезировать определенные последовательности коротких РНК без матрицы РНК [21]. Недавно аналогичный "безматричный" синтез РНК показан и для РНК полимеразы бактериофага T7 [5]. Такой же результат получен для синтеза РНК de novo посредством ДНК-зависимой РНК-полимеразы фагов Т7, Т3 и SP6 [Интернет]. В этих экспериментах снова нарушается центральная догма молекулярной биологии и генетики, постулирующая казалось бы незыблемое: ДНКРНКБЕЛОК. Это каноническое утверждение, что матрицами для синтеза ДНК или РНК могут служить только вещественные молекулы РНК или ДНК. Но в одном пункте эта догма уже модифицирована. Поток стратегической информации, как уже хорошо известно после открытия обратной транскриптазы, выглядит по другому: ДНКРНКБЕЛОК. Если учитывать "аномалии" при размножении прионов, то вполне возможна и еще одна поправка: ДНКРНКБЕЛОК, что будет обсуждаться ниже.
Поскольку "безматричный" синтез РНК приводит к необходимости дальнейших изменений в понимании работы генетического аппарата (по крайней мере, для низших биосистем) в научной литературе началась и продолжается обширная дискуссия о корректности "безматричных" экспериментов. Предельно высокая чистота опытов с Qb репликазой в отношении артефактов, связанных с наличием в реактивах и лабораторной посуде посторонних следовых примесей РНК, была достигнута уже в работе [21]. Было показано, что при понижении концентрации нуклеозид-трифосфатов ниже 0,15mM прекращается синтез РНК (в отсутствие матрицы), хот 0 0 x 0 x 0 x 0 x 0 x 0 x 0 x 0 x 0 0 0 0 0 x 0 x 0 x 0 x 0 x 0 x 0 0 x 0 x 0 0 x 0 x 0 0 x 0 x 0 x 0 x 0 0 0 0 0 x 0 0 0 0 x 0 x 0 x 0 x 0 x 0 x 0 0 0 x 0 0 0 0 x 0 x 0 x 0 x 0 x 0 x 0 x 0 0 x 0 x 0 x 0 x 60 x 0 x 0 x 0 0 0 0 x 0 x 0 x 0 x 0 x 0 x 0 0 x 0 x 0 0 x 0 0 x 0 x 0 x 0 x 0 x 0 x 0 0 x 0 x 0 x 0 x 0 x 0 x 0 x 0 x 0 0 0 x 0 x 0 0 x 0 x 0 0 x 0 x 0 x 0 x 0 x 0 x 0 0 x 0 x 0 0 x 0 0 0 0 0 x 0 x 0 x 0 0 x 0 x 0 10 x 0 \~0 0 \>0 0 \~0 0 \>0 0 @ "0 \>0 0 @ "0 \>0 0 \~0 0 V@ "0 @ "0 \~00 4W@ #0 \~0 0 V@ #0 \~0 0 V\>0 0 \>0 0 , [\>0 0 , [\>0 0 , [\>0 0 $ $ 8 8 L O t8 BL T ` `g p { ֈ ڥ ~ n # - > F T ` h r d| v Z j r ` & o s u w x z { | ~ 4 M Ni R ~# 9 P Tg R 2 & p r t v y } $ q $ / 5 8 C I O ! ! # $ / X b $ 'jf[Xr$b} @` b $ xYc~垯- nb @ # 0 ( B S ? ~ , " D Q % : [ + , : C *urn:schemas-microsoft-com:office:smarttagsmetricconverter 8 *urn:schemas-microsoft-com:office:smarttagstime 8 *urn:schemas-microsoft-com:office:smarttagsdate 01012132008 2 0 0 8 320112859DayHourlsMinuteMonth ProductIDtransYear i- x- / / Ob ^b e e ^ d n U m d " " % % * * , - G/ Q/ (0 20 B: M: : : fF H :L ?L GN RN U W W X X X n n r s t t , : d ٰ ڽ s N f C \ ^ f ! 4 4 36 96 6 6 8 8 "9 )9 "; (; <